寻源宝典7500PCR仪探针法上机步骤
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北京创誉科技有限公司
北京创誉科技有限公司,2013年成立于北京市,主营超微量分光光度计、核酸提取仪等,产品多样,权威可靠。
介绍:
本文详细介绍7500PCR仪探针法的完整上机流程,包括反应体系配制、程序参数设置和结果分析要点,帮助实验人员快速掌握关键操作技巧。
一、反应体系配制要点
就像做蛋糕需要精确配料一样,探针法PCR反应体系也需要严格配比:
模板DNA:建议浓度5-50ng/μl,避免过高导致抑制
探针与引物:探针终浓度100-300nM,引物终浓度200-600nM
预混液选择:含dNTPs、Mg²⁺和热启动酶的专用预混液更稳定
分装技巧:冰上操作,每管分装后短暂离心去除气泡
二、仪器程序设置秘籍
7500PCR仪就像智能烤箱,参数设置决定实验成败:
预变性阶段:95℃保持30秒,确保DNA完全解链
扩增循环:95℃ 5秒 + 60℃ 30秒,共40个循环
荧光采集:在60℃延伸步骤结束时采集FAM/HEX信号
熔解曲线:可选项,60-95℃以0.3℃/s速率升温
三、结果分析避坑指南
看到曲线别急着下结论,先检查这些细节:
基线设置:选择3-15循环的平稳信号段
阈值线:应位于指数增长期中间位置
阴性对照:必须无扩增曲线
复孔差异:Ct值差异应小于0.5个循环
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