WB跑内参：膜孔径怎么选

一、孔径选择：先看分子量，再看实验需求

跑内参时，膜孔径的核心原则是：让目标蛋白顺利通过，同时截留大分子杂质。常见孔径有0.22μm和0.45μm两种，选哪个要看你的内参蛋白大小：

• 小分子蛋白（<30kDa）：优先选0.22μm，过滤更彻底，能拦住大部分杂质，避免背景干扰。

• 大分子蛋白（>30kDa）：0.45μm更合适，孔径大不易堵，还能减少蛋白在膜上的吸附损失。

举个例子：跑β-actin（42kDa）用0.45μm，跑GAPDH（36kDa）也可选0.45μm；但跑Tubulin（50kDa）时，如果样品杂质多，0.22μm可能更稳妥。

二、避坑指南：这些操作会让你的膜“翻车”

选对孔径只是第一步，操作细节同样关键：

1. 预湿润膜：用缓冲液或水先润湿膜，避免干燥的膜吸附蛋白，导致信号减弱。

2. 避免反复过滤：一次过滤不完？别硬挤！反复过滤会损伤膜结构，甚至让蛋白变性。

3. 注意样品体积：样品太少（<100μL）时，优先选小体积滤器（如0.5mL），减少蛋白在管壁的残留。

三、进阶技巧：特殊情况这样处理

遇到这些“奇葩”情况，试试这些方法：

• 高粘度样品：比如细胞裂解液含大量DNA，容易堵膜。可以先离心（12000rpm，10min）去沉淀，再用0.45μm过滤。

• 低丰度蛋白：担心过滤损失？可以减少过滤体积（如用200μL样品+0.22μm滤器），或直接不过滤（但背景可能高）。

• 需要定量：过滤会损失部分蛋白，如果要做精确定量，建议用未过滤的样品作为对照。

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